近日，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所作物有害生物功能基因組研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)首次將SpCas9突變體SpG和SpRY應(yīng)用于植物，在水稻中實(shí)現(xiàn)NRN PAM和NYN PAM的靶向操作，開(kāi)發(fā)的系列工具大大擴(kuò)展了CRISPR系統(tǒng)在植物基因組中的應(yīng)用范圍。相關(guān)研究成果在線發(fā)表在《基因組生物學(xué)（Genome Biology）》上。
據(jù)周煥斌研究員介紹，近幾年來(lái)，基因組編輯技術(shù)發(fā)展迅速，并廣泛應(yīng)用于人類(lèi)基因治療、動(dòng)植物分子育種等各領(lǐng)域。由于傳統(tǒng)的化膿鏈球菌SpCas9和后期挖掘的各Cas蛋白為典型的富含鳥(niǎo)嘌呤G的PAM（G-PAM）識(shí)別類(lèi)型，在應(yīng)用中具有一定程度的局限性。研究人員一直在尋找各種新型CRISPR/Cas系統(tǒng)，以期突破對(duì)G-PAM識(shí)別特異性的限制，擴(kuò)展各基因編輯工具在生物體基因組中的靶向范圍。
該研究聚焦SpCas9的2個(gè)新型突變體SpG和SpRY，研究發(fā)現(xiàn)SpG對(duì)NG PAM具有偏好性，但其活性低于團(tuán)隊(duì)之前挖掘的突變體SpCas9-NG。而SpRY在大量基因組靶位點(diǎn)上實(shí)現(xiàn)了高效編輯，對(duì)富含鳥(niǎo)嘌呤G和腺嘌呤A的PAM均具有偏好性。基于SpRY切口酶開(kāi)發(fā)的胞嘧啶堿基編輯器rBE66通過(guò)識(shí)別NAG PAM對(duì)2個(gè)靶基因?qū)崿F(xiàn)靶堿基定向編輯，編輯效率分別為26.00%和4.26%。將SpRY切口酶和腺苷脫氨酶TadA8e融合而開(kāi)發(fā)的腺嘌呤堿基編輯器rBE62，能夠有效識(shí)別NAA、NAT和NAC PAM，對(duì)3個(gè)靶基因的堿基編輯效率分別高達(dá)29.79%、93.75%和51.28%。此外，該研究揭示了SpRY具有高頻的自編輯事件（即對(duì)T-DNA上的引導(dǎo)RNA序列進(jìn)行編輯），而SpRY切口酶介導(dǎo)的堿基編輯的自編輯事件較低頻發(fā)生。這些結(jié)果表明SpRY可用于水稻基因組定點(diǎn)編輯，尤其是單堿基編輯，并擴(kuò)寬了CRISPR技術(shù)在植物基因組中編輯范圍。該研究成果為后續(xù)基因組編輯衍生工具開(kāi)發(fā)，以及將來(lái)植物基因功能研究材料和新種質(zhì)材料的定制提供了有力的理論指導(dǎo)和技術(shù)支撐。
該研究得到中國(guó)國(guó)家自然科學(xué)基金、中國(guó)農(nóng)科院科技創(chuàng)新工程等項(xiàng)目支持。
據(jù)周煥斌研究員介紹，近幾年來(lái)，基因組編輯技術(shù)發(fā)展迅速，并廣泛應(yīng)用于人類(lèi)基因治療、動(dòng)植物分子育種等各領(lǐng)域。由于傳統(tǒng)的化膿鏈球菌SpCas9和后期挖掘的各Cas蛋白為典型的富含鳥(niǎo)嘌呤G的PAM（G-PAM）識(shí)別類(lèi)型，在應(yīng)用中具有一定程度的局限性。研究人員一直在尋找各種新型CRISPR/Cas系統(tǒng)，以期突破對(duì)G-PAM識(shí)別特異性的限制，擴(kuò)展各基因編輯工具在生物體基因組中的靶向范圍。
該研究聚焦SpCas9的2個(gè)新型突變體SpG和SpRY，研究發(fā)現(xiàn)SpG對(duì)NG PAM具有偏好性，但其活性低于團(tuán)隊(duì)之前挖掘的突變體SpCas9-NG。而SpRY在大量基因組靶位點(diǎn)上實(shí)現(xiàn)了高效編輯，對(duì)富含鳥(niǎo)嘌呤G和腺嘌呤A的PAM均具有偏好性。基于SpRY切口酶開(kāi)發(fā)的胞嘧啶堿基編輯器rBE66通過(guò)識(shí)別NAG PAM對(duì)2個(gè)靶基因?qū)崿F(xiàn)靶堿基定向編輯，編輯效率分別為26.00%和4.26%。將SpRY切口酶和腺苷脫氨酶TadA8e融合而開(kāi)發(fā)的腺嘌呤堿基編輯器rBE62，能夠有效識(shí)別NAA、NAT和NAC PAM，對(duì)3個(gè)靶基因的堿基編輯效率分別高達(dá)29.79%、93.75%和51.28%。此外，該研究揭示了SpRY具有高頻的自編輯事件（即對(duì)T-DNA上的引導(dǎo)RNA序列進(jìn)行編輯），而SpRY切口酶介導(dǎo)的堿基編輯的自編輯事件較低頻發(fā)生。這些結(jié)果表明SpRY可用于水稻基因組定點(diǎn)編輯，尤其是單堿基編輯，并擴(kuò)寬了CRISPR技術(shù)在植物基因組中編輯范圍。該研究成果為后續(xù)基因組編輯衍生工具開(kāi)發(fā)，以及將來(lái)植物基因功能研究材料和新種質(zhì)材料的定制提供了有力的理論指導(dǎo)和技術(shù)支撐。
該研究得到中國(guó)國(guó)家自然科學(xué)基金、中國(guó)農(nóng)科院科技創(chuàng)新工程等項(xiàng)目支持。
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